Pregabalin není agonista receptoru GABAA ani GABAB.
Pregabalin je gabapentinoid a působí tak, že inhibuje určité vápníkové kanály.Konkrétně jde o ligand pomocného místa podjednotky a25 určitých napěťově závislých vápníkových kanálů (VDCC), a tím působí jako inhibitor VDCC obsahujících podjednotku a28.Existují dvě podjednotky α2δ vázající léčivo, α2δ-1 a α2δ-2, a pregabalin vykazuje podobnou afinitu k těmto dvěma místům (a tedy nedostatek selektivity mezi nimi).Pregabalin je selektivní ve své vazbě na podjednotku α2δ VDCC.Navzdory skutečnosti, že pregabalin je analog GABA, neváže se na receptory GABA, nekonvertuje na GABA nebo jiného agonistu receptoru GABA in vivo a přímo nemoduluje transport nebo metabolismus GABA.Bylo však zjištěno, že pregabalin způsobuje na dávce závislé zvýšení mozkové exprese dekarboxylázy kyseliny L-glutamové (GAD), enzymu odpovědného za syntézu GABA, a proto může mít určité nepřímé GABAergní účinky zvýšením hladin GABA v mozku.V současnosti neexistuje žádný důkaz, že účinky pregabalinu jsou zprostředkovány jiným mechanismem než inhibicí VDCC obsahujících α2δ.V souladu s tím se zdá, že inhibice VDCC obsahujících α2δ-1 pregabalinem je zodpovědná za jeho antikonvulzivní, analgetické a anxiolytické účinky.
Endogenní α-aminokyseliny L-leucin a L-isoleucin, které se chemickou strukturou velmi podobají pregabalinu a dalším gabapentinoidům, jsou zjevnými ligandy podjednotky α2δ VDCC s podobnou afinitou jako gabapentinoidy (např. IC50 = 71 nM pro L- isoleucin) a jsou přítomny v lidském mozkomíšním moku v mikromolárních koncentracích (např. 12,9 uM pro L-leucin, 4,8 uM pro L-isoleucin).Existuje teorie, že mohou být endogenními ligandy podjednotky a že mohou kompetitivně antagonizovat účinky gabapentinoidů.V souladu s tím, zatímco gabapentinoidy jako pregabalin a gabapentin mají nanomolární afinity k a25 podjednotce, jejich účinnost in vivo je v nízkém mikromolárním rozsahu a za tento rozpor je pravděpodobně zodpovědná kompetice o vazbu endogenními L-aminokyselinami.

V jedné studii bylo zjištěno, že pregabalin má 6krát vyšší afinitu než gabapentin k VDCC obsahujícím α2δ podjednotku.Jiná studie však zjistila, že pregabalin a gabapentin mají podobné afinity pro lidskou rekombinantní podjednotku α2δ-1 (Ki = 32 nM a 40 nM, v daném pořadí).V každém případě je pregabalin jako analgetikum 2 až 4krát účinnější než gabapentin a u zvířat se zdá být 3 až 10krát účinnější než gabapentin jako antikonvulzivum.